cardiotomskСибирский журнал клинической и экспериментальной медициныSiberian Journal of Clinical and Experimental Medicine2713-29272713-265XTSU publishing10.29001/2073-8552-2022-37-3-121-127cardiotomsk-1513Research ArticleЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯEXPERIMENTAL STUDIESУровень оксидативного стресса в эндотелиальных клетках, культивируемых в присутствии митомицина СOxidative stress in the endothelial cell culture exposed to mitomycin Chttps://orcid.org/0000-0002-4824-2418СиницкийМ. Ю.SinitskyM. Yu.

Синицкий Максим Юрьевич, канд. биол. наук, старший научный сотрудник, лаборатория геномной медицины, отдел экспериментальной медицины

650002, Кемерово, Сосновый б-р, 6

Maxim Yu. Sinitsky, Cand. Sci. (Biol.), Senior Research Scientist, Laboratory of Genomic Medicine, Department of Experimental Medicine

6, Sosnovy blvd, Kemerovo, 650002

max-sinitsky@rambler.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4467-8732СиницкаяА. В.SinitskayaA. V.

Синицкая Анна Викторовна, канд. биол. наук, научный сотрудник, лаборатория геномной медицины, отдел экспериментальной медицины

650002, Кемерово, Сосновый б-р, 6

Anna V. Sinitskaya, Cand. Sci. (Biol.), Research Scientist, Laboratory of Genomic Medicine

6, Sosnovy blvd, Kemerovo, 650002

cepoav1991@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-1518-3888ШишковаД. К.ShishkovaD. K.

Шишкова Дарья Кирилловна, канд. биол. наук, научный сотрудник, лаборатория молекулярной, трансляционной и цифровой медицины, отдел экспериментальной медицины,

650002, Кемерово, Сосновый б-р, 6

Daria K. Shishkova, Cand. Sci. (Biol.), Research Scientist, Laboratory of Molecular, Translational, and Digital Medicine, Department of Experimental Medicine

6, Sosnovy blvd, Kemerovo, 650002

shishkovadk@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-0747-2495АсановМ. А.AsanovM. A.

Асанов Максим Айдарович, младший научный сотрудник, лаборатория геномной медицины, отдел экспериментальной медицины

650002, Кемерово, Сосновый б-р, 6

Maxim A. Asanov, Junior Research Scientist, Laboratory of Genomic Medicine, Department of Experimental Medicine

6, Sosnovy blvd, Kemerovo, 650002

asmaks988@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-9714-4080ХуторнаяМ. В.KhutornayaM. V.

Хуторная Мария Владимировна, младший научный сотрудник, лаборатория геномной медицины, отдел экспериментальной медицины

650002, Кемерово, Сосновый б-р, 6

Maria V. Khutornaya, Junior Research Scientist, Laboratory of Genomic Medicine, Department of Experimental Medicine

6, Sosnovy blvd, Kemerovo, 650002

masha_hut@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3002-2863ПонасенкоА. В.PonasenkoA. V.

Понасенко Анастасия Валериевна, канд. мед. наук, заведующий лабораторией геномной медицины, отдел экспериментальной медицины

650002, Кемерово, Сосновый б-р, 6

Anastasia V. Ponasenko, Cand. Sci. (Med.), Head of the Laboratory of Genomic Medicine, Department of Experimental Medicine

6, Sosnovy blvd, Kemerovo, 650002

ponaav@kemcardio.ruНаучно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеванийРоссияResearch Institute for Complex Issues of Cardiovascular DiseasesRussian Federation202220102022373121127Copyright © Синицкий М.Ю., Синицкая А.В., Шишкова Д.К., Асанов М.А., Хуторная М.В., Понасенко А.В., 20222022Синицкий М.Ю., Синицкая А.В., Шишкова Д.К., Асанов М.А., Хуторная М.В., Понасенко А.В.Sinitsky M.Y., Sinitskaya A.V., Shishkova D.K., Asanov M.A., Khutornaya M.V., Ponasenko A.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.sibjcem.ru/jour/article/view/1513

Обоснование. Атеросклероз – одна из ведущих патологий сердечно-сосудистой системы. Показано, что одним из факторов риска данного заболевания является повреждение ДНК эндотелиальных клеток, приводящее к эндотелиальной дисфункции и вызванное воздействием на клетки мутагена митомицина С (ММС). ММС оказывает алкилирующее действие на ДНК и вовлечен в процесс формирования оксидативного стресса, также являющегося фактором риска развития атеросклероза.Цель исследования: оценить уровень маркеров оксидативного стресса в культурах первичных эндотелиальных клеток человека, экспонированных мутагеном алкилирующего механизма действия ММС.Материал и методы. Материалом исследования послужили коммерческие культуры первичных эндотелиальных клеток коронарной (HCAEC) и внутренней грудной (HITAEC) артерий человека, культивируемые в присутствии 500 нг/мл ММС (экспериментальная группа) и без мутагенной нагрузки (контрольная группа). Уровень активных форм кислорода, азота и 8-OH-дезоксигуанозина (8-OHdG) определяли в культуральной среде методом иммуноферментного анализа (ИФА). Относительную длину теломерных участков ДНК эндотелиальных клеток, а также экспрессию генов TERT и POT1 оценивали с помощью метода количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени. Статистическую обработку результатов исследования проводили в программе GraphPad Prism 9.Результаты. В результате проведенной работы установлено, что концентрация активных форм кислорода, реактивных форм азота (NO2 –, NO3 –, NO2 –/NO3 –) и 8-OHdG статистически значимо не различалась в экспериментальной и контрольной группах клеток HCAEC и HITAEC. При этом в экспонированных ММС клетках HCAEC и HITAEC отмечено уменьшение относительной длины теломерных участков ДНК по сравнению с неэкспонированным контролем (10,97 против 27,03 в клетках HCAEC, p = 0,002 и 9,12 против 25,64 в клетках HITAEC, p = 0,001). Кроме того, в экспонированных ММС клетках HCAEC установлено 1,75-кратное повышение экспрессии гена POT1 относительно контроля (p = 0,019). Ген TERT не экспрессировался ни в одной из изученных групп.Заключение. Мутаген алкилирующего механизма действия ММС в эксперименте in vitro не вызывает выраженный оксидативный стресс в культурах первичных эндотелиальных клеток человека. Формирование эндотелиальной дисфункции, ассоциированной с экспозицией клеток ММС, обусловлено, главным образом, генотоксическим стрессом, связанным с алкилированием ДНК эндотелиальных клеток.

Background

Background. Atherosclerosis is one of the leading cardiovascular pathologies. Evidence suggests that DNA damage caused by endothelial cell exposure to mitomycin C (MMC) leads to endothelial dysfunction and is the risk factor for this disease. MMC is an alkylating mutagen involved in the development of oxidative stress, which is also a risk factor for atherosclerosis. Aim. To access the levels of oxidative stress markers in the primary human endothelial cell culture exposed to alkylating mutagen MMC.

Material and Methods

Material and Methods. Commercially available primary cultures of endothelial cells obtained from human coronary artery (HCAEC) and human internal thoracic artery (HITAEC) were used in the study. The cells were cultivated in the presence of 500 ng/mL MMC (experimental group) and without mutagenic load (control group). The levels of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and 8-OH-deoxyguanosine (8-OHdG) in cell growth media were assessed by enzyme-linked immunosorbent assay. The relative telomere length and expression of TERT and POT1 genes were accessed in endothelial cells by quantitative polymerase chain reaction. Statistical analysis of data was performed using GraphPad Prism 9 software.

Results

Results. There were no differences in the concentrations of reactive oxygen species, reactive nitrogen species (NO2 -, NO3 -, NO2 -/NO3 -), and 8-OHdG in HCAEC and HITAEC cultures exposed to MMC compared to the corresponding parameters in the non-exposed controls. At the same time, HCAEC and HITAEC exposed to MMC were characterized by a decrease in the relative telomere length compared to control (10.97 vs. 27.03 in HCAEC, p = 0.002 and 9.12 vs. 25.64 in HITAEC, p = 0.001). Moreover, we discovered 1.75-fold increase in the expression of POT1 gene in the experimental HCAEC compared to control (p = 0.019). No expression of TERT gene was observed in study groups.

Conclusions

Conclusions. Alkylating mutagen MMC did not induce any pronounced oxidative stress in the primary human endothelial cells in vitro. The development of endothelial dysfunction caused by MMC exposure was triggered mainly by DNA alkylation resulting in the genotoxic stress in the endothelial cells.

эндотелиальная дисфункцияоксидативный стрессмутагенезатерогенезтеломерытеломеразаendothelial dysfunctionoxidative stressmutagenesisatherogenesistelomeretelomeraseИсследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 21-75-10052 «Молекулярные механизмы развития эндотелиальной дисфункции в ответ на генотоксический стресс», https://rscf.ru/project/21-75-10052/.ReferencesGlobal, regional, and national age-sex-specifi c mortality for 282 causes of death in 195 countries and territories, 1980–2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 2018;392(10159):1736–1788. DOI: 10.1016/S0140-6736(18)32203-7.Global, regional, and national age-sex-specifi c mortality for 282 causes of death in 195 countries and territories, 1980–2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 2018;392(10159):1736–1788. DOI: 10.1016/S0140-6736(18)32203-7.Libby P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 2021;592(7855):524–533. DOI: 10.1038/s41586-021-03392-8.Libby P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 2021;592(7855):524–533. DOI: 10.1038/s41586-021-03392-8.Кутихин А.Г., Синицкий М.Ю., Понасенко А.В. Роль мутагенеза в развитии атеросклероза. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2017;(1):92–101. DOI: 10.17802/2306-1278-2017-1-92-101.Kutikhin A.G., Sinitsky M.Y., Ponasenko A.V. The role of mutagenesis in atherosclerosis. Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2017;(1):92–101. (In Russ.). DOI: 10.17802/2306-1278-2017-1-92-101.Borghini A., Cervelli T., Galli A., Andreassi M.G. DNA modifi cations in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 2013;230(2):202–209. DOI: 10.1016/j.atherosclerosis.2013.07.038.Borghini A., Cervelli T., Galli A., Andreassi M.G. DNA modifi cations in atherosclerosis: From the past to the future. Atherosclerosis. 2013;230(2):202–209. DOI: 10.1016/j.atherosclerosis.2013.07.038.Nair J., De Flora S., Izzotti A., Bartsch H. Lipid peroxidation-derived etheno-DNA adducts in human atherosclerotic lesions. Mutat. Res. 2007;621(1–2):95–105. DOI: 10.1016/j.mrfmmm.2007.02.013.Nair J., De Flora S., Izzotti A., Bartsch H. Lipid peroxidation-derived etheno-DNA adducts in human atherosclerotic lesions. Mutat. Res. 2007;621(1–2):95–105. DOI: 10.1016/j.mrfmmm.2007.02.013.Синицкий М.Ю., Цепокина А.В., Кутихин А.Г., Шишкова Д.К., Понасенко А.В. Профиль генной экспрессии в эндотелиальных клетках, культивируемых в присутствии митомицина С. Биомедицинская химия. 2021;67(3):130–136. DOI: 10.18097/PBMC20216702130.Sinitsky M.Y., Tsepokina A.V., Kutikhin A.G., Shishkova D.K., Ponasenko A.V. The gene expression signature in endothelial cells exposed to mitomycin C. Biomedical Chemistry. 2021;67(3):130–136. (In Russ.). DOI: 10.18097/PBMC20216702130.Lee Y.J., Park S.J., Ciccone S.L., Kim C.R., Lee S.H. An in vivo analysis of MMC-induced DNA damage and its repair. Carcinogenesis. 2006;27(3):446–453. DOI: 10.1093/carcin/bgi254.Lee Y.J., Park S.J., Ciccone S.L., Kim C.R., Lee S.H. An in vivo analysis of MMC-induced DNA damage and its repair. Carcinogenesis. 2006;27(3):446–453. DOI: 10.1093/carcin/bgi254.Klaunig J.E., Wang Z., Pu X., Zhou S. Oxidative stress and oxidative damage in chemical carcinogenesis. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2011;254(2):86–99. DOI: 10.1016/j.taap.2009.11.028.Klaunig J.E., Wang Z., Pu X., Zhou S. Oxidative stress and oxidative damage in chemical carcinogenesis. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2011;254(2):86–99. DOI: 10.1016/j.taap.2009.11.028.Sims F.H. A comparison of coronary and internal mammary arteries and implications of the results in the etiology of atherosclerosis. Am. Heart J. 1983;105(4):560–566.Sims F.H. A comparison of coronary and internal mammary arteries and implications of the results in the etiology of atherosclerosis. Am. Heart J. 1983;105(4):560–566.Cawthon R.M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 2002;30(10):e47. DOI: 10.1093/nar/30.10.e47.Cawthon R.M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 2002;30(10):e47. DOI: 10.1093/nar/30.10.e47.Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M. et al. The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem. 2009;55(4):611–622. DOI: 10.1373/clinchem.2008.112797.Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M. et al. The MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem. 2009;55(4):611–622. DOI: 10.1373/clinchem.2008.112797.Gnad-Vogt S.U., Hofheinz R.D., Saussele S., Kreil S., Willer A., Willeke F. et al. Pegylated liposomal doxorubicin and mitomycin C in combination with infusional 5-fl uorouracil and sodium folinic acid in the treatment of advanced gastric cancer: Results of a phase II trial. Anticancer Drugs. 2005;16(4):435–440. DOI: 10.1097/00001813-200504000-00010.Gnad-Vogt S.U., Hofheinz R.D., Saussele S., Kreil S., Willer A., Willeke F. et al. Pegylated liposomal doxorubicin and mitomycin C in combination with infusional 5-fl uorouracil and sodium folinic acid in the treatment of advanced gastric cancer: Results of a phase II trial. Anticancer Drugs. 2005;16(4):435–440. DOI: 10.1097/00001813-200504000-00010.Cadet J., Davies K.J.A., Medeiros M.H., Di Mascio P., Wagner J.R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radic. Biol. Med. 2017;107:13–34. DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2016.12.049.Cadet J., Davies K.J.A., Medeiros M.H., Di Mascio P., Wagner J.R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radic. Biol. Med. 2017;107:13–34. DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2016.12.049.Radi R. Peroxynitrite, a stealthy biological oxidant. J. Biol. Chem. 2013;288(37):26464–26472. DOI: 10.1074/jbc.R113.472936.Radi R. Peroxynitrite, a stealthy biological oxidant. J. Biol. Chem. 2013;288(37):26464–26472. DOI: 10.1074/jbc.R113.472936.Shekaftik O.S., Nasirzadeh N. 8-Hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG) as a biomarker of oxidative DNA damage induced by occupational exposure to nanomaterials: А systematic review. Nanotoxicology. 2021;15(6):850–864. DOI: 10.1080/17435390.2021.1936254.Shekaftik O.S., Nasirzadeh N. 8-Hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-OHdG) as a biomarker of oxidative DNA damage induced by occupational exposure to nanomaterials: А systematic review. Nanotoxicology. 2021;15(6):850–864. DOI: 10.1080/17435390.2021.1936254.Kiecolt-Glaser J.K., Epel E.S., Belury M.A., Andridge R., Lin J., Glaser R. et al. Omega-3 fatty acids, oxidative stress, and leukocyte telomere length: A randomized controlled trial. Brain Behav. Immun. 2013;28:16–24. DOI: 10.1016/j.bbi.2012.09.004.Kiecolt-Glaser J.K., Epel E.S., Belury M.A., Andridge R., Lin J., Glaser R. et al. Omega-3 fatty acids, oxidative stress, and leukocyte telomere length: A randomized controlled trial. Brain Behav. Immun. 2013;28:16–24. DOI: 10.1016/j.bbi.2012.09.004.Lipcsey M., Söderberg E., Basu S., Larsson A., Sjölin J., Aström M. et al. F2-isoprostane, infl ammation, cardiac function and oxygenation in the endotoxaemic pig. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 2008;78(3):209–217. DOI: 10.1016/j.plefa.2008.01.006.Lipcsey M., Söderberg E., Basu S., Larsson A., Sjölin J., Aström M. et al. F2-isoprostane, infl ammation, cardiac function and oxygenation in the endotoxaemic pig. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 2008;78(3):209–217. DOI: 10.1016/j.plefa.2008.01.006.Wang L., Yu X., Liu J.P. Telomere damage response and low-grade infl ammation. Adv. Exp. Med. Biol. 2017;1024:213–224. DOI: 10.1007/978-981-10-5987-2_10.Wang L., Yu X., Liu J.P. Telomere damage response and low-grade infl ammation. Adv. Exp. Med. Biol. 2017;1024:213–224. DOI: 10.1007/978-981-10-5987-2_10.Aramburu T., Plucinsky S., Skordalakes E. POT1-TPP1 telomere length regulation and disease. Comput. Struct. Biotechnol. J. 2020;18:1939–1946. DOI: 10.1016/j.csbj.2020.06.040.Aramburu T., Plucinsky S., Skordalakes E. POT1-TPP1 telomere length regulation and disease. Comput. Struct. Biotechnol. J. 2020;18:1939–1946. DOI: 10.1016/j.csbj.2020.06.040.Zvereva M.I., Shcherbakova D.M., Dontsova O.A. Telomerase: Structure, functions, and activity regulation. Biochemistry (Mosc.). 2010;75(13):1563–1583. DOI: 10.1134/s0006297910130055.Zvereva M.I., Shcherbakova D.M., Dontsova O.A. Telomerase: Structure, functions, and activity regulation. Biochemistry (Mosc.). 2010;75(13):1563–1583. DOI: 10.1134/s0006297910130055.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.