Модификация метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для количественного определения концентрации ривароксабана в крови

Введение. Достижение терапевтических концентраций прямых оральных антикоагулянтов (ПОАК) и, соответственно, персонификация антикоагулянтной терапии в определенных группах пациентов становятся все более актуальными. Для оптимизации лекарственного мониторинга в рутинной клинической практике необходима разработка и апробация чувствительных и селективных методик, с помощью которых возможно количественное определение в крови содержания ПОАК, в том числе ривароксабана.

Цель исследования: модифицировать метод определения концентрации ривароксабана в крови с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), а также провести апробацию подобранных условий для определения концентрации препарата в цельной венозной крови пациентов.

Материал и методы. Для первого этапа работ образцами для исследования являлись пробы крови (n = 20) здоровых добровольцев (n = 5), не принимающих лекарственные препараты. Забор крови из периферической вены осуществляли с использованием вакуумной системы в объеме 6 мл. Пробирки для забора крови использовали с четырьмя разными наполнениями. Перед подготовкой образцы делили на 6 частей и в каждую делали добавку раствора ривароксабана различной концентрации, приготовленного из чистого вещества Rivaroxaban (Индия). Далее проводили жидкостную экстракцию ривароксабана ацетонитрилом из пробы цельной венозной крови с параллельным устранением мешающего влияния белков путем их осаждения хлористым никелем. Разделение компонентов пробы осуществляли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на жидкостном хроматографе (1260 Infinity II LC). Аналитический сигнал на диодно-матричном детекторе (1260 DAD WR, Agilent Technologies) фиксировали при двух длинах волн - 254 и 280 нм. Для второго этапа работ образцами для исследования являлись пробы цельной венозной крови пациентов (n = 54), принимающих ривароксабан (Bayer, Германия). Забор крови производится утром, натощак, через 12 ч после приема последней дозы препарата (20 мг/сут).

Результаты. Авторами были исследованы и установлены факторы, влияющие на уменьшение предела обнаружения ривароксабана в крови при определении его методом ВЭЖХ с использованием жидкостного хроматографа Agilent 1260 с диодно-матричным детектором (Agilent Technologies, Германия). Для оценки степени извлечения ривароксабана и выбора рабочей длины волны были построены градуировочные зависимости антикоагулянта в исходных растворах ацетонитрила и графики изменения площадей пика ривароксабана от его содержания в крови: при длине волны 254 нм (R2 = 0,98) и 280 нм (R2 = 0,99). Функция зависимости при длине волны 254 нм имеет больший угловой коэффициент, что позволяет снизить предел обнаружения определяемого вещества. Содержание диоксида кремния в пробирке не оказывает значимого влияния на аналитический сигнал ривароксабана (минимальное значение пределов обнаружения - 0,25 мкг/мл, минимальное значение пределов определения - 0,77 мкг/мл), а также не вносит дополнительной погрешности в точность метода. Медиана концентрации ривароксабана составила 0,32 мкг/мл (0,26; 0,49) через 12 ч от приема препарата.

Заключение. Применение модифицированного метода ВЭЖХ с выбором длины волн 254 нм для детектирования аналитического сигнала позволяет снизить предел обнаружения определяемого вещества и увеличить диапазон определяемых концентраций. Использование пробирок с диоксидом кремния можно рекомендовать для снижения влияния матричного эффекта на количественное определение ривароксабана в крови и увеличения точности метода.

1. Benjamin E.J., Muntner P., Alonso A., Bittencourt M.S., Callaway C.W., Carson A.P. et al. American Heart Association Council on Epidemiology and Prevention Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Heart disease and stroke statistics 2019 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 2019;10(139):e56e528. https://doi.org/10.1161/CIR.0000000000000659

2. Kamel H., Healey J.S. Cardioembolic Stroke. Circ. Res. 2017;120(3):514–526. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.116.308407

3. Сорокоумов В.А. Антикоагулянтная терапия для профилактики повторного инсульта у пациентов с фибрилляцией предсердий: комплексное управление рисками. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2022;21(1):3122. https://doi.org/10.15829/1728-8800-2022-3122

4. Михайлова З.Д., Черепанова В. В., Михайлова Ю. В. Тромбоэмболические осложнения на фоне антитромботической терапии: взгляд кардиолога и гематолога. Кардиология: Новости. Мнения. Обучение. 2018;1(16):65–73. https://doi.org/10.24411/2309-1908-2018-00002

5. Взаимосвязь приема ривароксабана и апиксабана с большими ишемическими или геморрагическими событиями у пациентов с фибрилляцией предсердий. Ретроспективное когортное исследование реальной клинической практики. Пресс релиз. Российский кардиологический журнал. 2022;27(1S):4906. https://doi.org/10.15829/1560-4071-2022-4906

6. Заиграев И.А., Явелов И.С., Драпкина О.М., Базаева Е.В. Предикторы тромбоза левого предсердия и его ушка перед катетерной аблацией или кардиоверсией у больных с неклапанной фибрилляцией или трепетанием предсердий. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2022;21(12):3443. https://doi.org/10.15829/1728-8800-2022-3443

7. Баранова Е.И., Ионин В.А., Кацап А.А., Колесник О.С., Лебедева Е.В. Безопасность лечения прямыми оральными антикоагулянтами больных с фибрилляцией предсердий и высоким риском инсульта (обзор литературы). Ученые записки СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. 2019;26(3):43–56. https://doi.org/10.24884/1607-4181-2019-26-3-43-56

8. Эшматов О.P., Баталов P.Е., Драгунова М.А., Арчаков Е.А., Попов С.В. Эффективность и безопасность антикоагулянтной терапии в реальной клинической практике у пациентов c персистирующей формой фибрилляции предсердий после интервенционного лечения. Вестник аритмологии, 2021;28(3):21–27. https://doi.org/10.35336/VA-2021-3-21-27

9. Ситкова Е.С., Драгунова М.А., Огуркова О.Н., Сморгон А.В., Московских Т.В., Баталов Р.Е. и др. Спонтанная и стимулированная агрегационная активность тромбоцитов у пациентов с фибрилляцией предсердий и тромботическими осложнениями. Сибирский журнал клинической и экспериментальной медицины. 2023;38(4):116–124. https://doi.org/10.29001/2073-8552-2023-38-4-116-124

10. Jakowenko N., Nguyen S., Ruegger M., Dinh A., Salazar E., Donahue K.R. Apixaban and rivaroxaban anti-Xa level utilization and associated bleeding events within an academic health system. Thromb. Res. 2020;196:276–282. https://doi.org/10.1016/j.thromres.2020.09.002

11. Ngo L.T., Yang S.Y., Shin S., Cao D.T., Van Nguyen H., Jung S. et al. Application of physiologically-based pharmacokinetic model approach to predict pharmacokinetics and drug-drug interaction of rivaroxaban: A case study of rivaroxaban and carbamazepine. CPT Pharmacometrics Syst. Pharmacol. 2022;11(11):1430–1442. https://doi.org/10.1002/psp4.12844

12. Samama M.M. The mechanism of action of rivaroxaban–an oral, direct Factor Xa inhibitor-compared with other anticoagulants. Thromb. Res. 2011;127(6):497–504. https://doi.org/10.1016/j.thromres.2010.09.008

13. Kubitza D., Becka M., Roth A., Mueck W. Dose-escalation study of the pharmacokinetics and pharmacodynamics of rivaroxaban in healthy elderly subjects. Current Medical Research and Opinion. 2008;24(10):2757–2765. https://doi.org/10.1185/03007990802361499

14. Mashru R., Koshti N. Development and validation of UV-Spectrophotometric and RP-HPLC method for simultaneous estimation of Metformin and Doxycycline in bulk and synthetic mixture. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 2021;11(4-S):26–35. https://doi.org/10.22270/jddt.v11i4-S.4964

15. Shukla A.H., Shah P.J., Dedhiya P.P., Vyas B.A., Shah S.A. Development and validation of a HPTLC method for rivaroxaban in human plasma for a pharmacokinetic study. Indian J. Pharm. Sci. 2020;82(2):315–320. https://doi.org/10.36468/pharmaceutical-sciences.652

16. Родина Т.А., Мельников Е.С., Аксенов А.А., Белков С.А., Соколов А.В., Прокофьев А.Б. и др. Разработка методики количественного определения ривароксабана в сыворотке крови человека методом ВЭЖХ-МС/МС. Химико-фармацевтический журнал. 2018;52(4):59–64. https://doi.org/10.30906/0023-1134-2018-52-4-59-64

17. Вавилова Т.В. Антикоагулянтная активность прямых ингибиторов фактора Ха свертывания крови как инструмент обеспечения эффективности и безопасности приема препаратов. Кардиология. 2019;59(11S):28–35. https://doi.org/10.18087/cardio.n951

18. dos Santos N.O., Wingert N.R., Steppe M. Quality by design approach for enantiomeric evaluation by RP-HPLC method of Rivaroxaban and its chiral impurity. Microchemical Journal. 2023;192:108911. https://doi.org/10.1016/j.microc.2023.108911

19. Samama M.M., Contant G., Spiro T.E., Perzborn E., Le Flem L., Guinet C. et al. Laboratory assessment of rivaroxaban: a review. Thrombosis J. 2013;11(1):11. https://doi.org/10.1186/1477-9560-11-11

20. Cini M., Legnani C., Padrini R., Cosmi B., Dellanoce C., De Rosa G. et al. DOAC plasma levels measured by chromogenic anti-Xa assays and HPLC-UV in apixaban- and rivaroxaban-treated patients from the START-Register. Int. J. Lab. Hematol. 2020;42(2):214–222. https://doi.org/10.1111/ijlh.13159